天然染色体基本功能单位包括複製起始点(replication origin)、着丝粒(centromere)和端粒(telomere)。複製起始点，保证了染色体複製，着丝粒保证了染色体分离，端粒封闭了染色体末端，防止粘附到其他断裂端，保证了染色体的稳定存在。

人工染色体

人们为了克隆大片段DNA，利用DNA体外重组技术分离了天然染色体的基本功能元件并将它们连线起来，从而构成了人工染色体。相比于其他複製子而言，染色体要大得多。

染色体

酵母人工染色体（YAC)是人工染色体中能克隆最大DNA片段的载体，可以插入100-2000kb的外源DNA片段。YAC是有酵母的自主複製序列、着丝点、四膜虫的端粒以及酵母选择性标记组成的酵母线性克隆载体。左臂含有端粒、酵母筛选标记Trp1、自主複製序列ARS和着丝粒，右臂含有酵母筛选标记Ura3和端粒，然后在两臂之间插入大片段DNA构成的。

可以容纳更长的DNA片段，用较少的克隆就可以包含特定的基因组全部序列，从而保持了基因组特定序列的完整性，有利于物理图谱的製作。

（1）克隆外源基因易出现嵌合体。

（2）有些克隆不稳定。

（3）YAC克隆不容易与酵母自身染色体相分离。

在染色体区带构建YAC重叠群，可以促进大规模基因组测序和致病基因的克隆。

细菌人工染色体（BAC)是以细菌F因子为基础构建的细菌克隆载体。BAC克隆容量可以达300，可以通过电穿孔导入细菌细胞。

人工染色体

拷贝数低，稳定，比YAC易分离。

P1噬菌体载体是在P1噬菌体的基础上构建的克隆载体，用于克隆真核基因组DNA。

P1派生人工染色体（PAC)是将BAC和P1噬菌体载体二者优点结合起来的克隆体系，可以克隆100-300kb的外源DNA片段。

（1）含有卡那霉素抗性基因，便于筛选

（2）由于其在宿主细胞中以单拷贝的形式存在，避免了因多拷贝造成的不稳定。

哺乳动物人工染色体（MAC）指从哺乳动物细胞中分离出複製起始区、端粒以及着丝粒构建而成的克隆载体。它可以克隆大于1000kb的外源DNA片段。

（1）有丝分裂和减数分裂对DNA片段大小的定量分析。

（2）研究哺乳动物细胞中染色体功能。

（3）对複杂的基因做功能分析。

（4）用于体细胞基因治疗。

人类游离人工染色体（HAEC）是基于人类EB病毒而构建的环形DNA，含有EB病毒的複製原点(oriP)和潮霉素抗性基因。能以环形小染色体形式複製，并在有丝分裂中保持稳定。HAEC可能会成为基因治疗的重要载体。

人工染色体

1983年，美国的Dana-Farber癌症研究所和哈佛大学医学院的教授首次在Nature上发表文章，报导了构建YAC(Yeast Artificial Chromosome)库的过程。1987年，Burke等人发现，仅仅带有ARS序列的载体虽然能够被複製，但极易在有丝分裂时丢失。即使在选择培养基上，也只有5%-20%的子代细胞带有ARS载体。加入Centromeres (CEN)能显着提高ARS质粒在有丝分裂时的稳定性，90%以上子代细胞带有该载体。CEN还能显着降低拷贝数，从20-50/细胞降为1-2/细胞.(Science, 236:806-812)。

人工染色体含有三种必需成分：着丝粒，端粒和複製起点。着丝粒(CEN)位于染色体中央，呈纽扣状结构，在有丝分裂时结合微管并调控染色体的运动，也是姐妹染色单体配对时的最后位点，接收细胞信号而使姐妹染色体分开。端粒(TEL):主要功能是防止染色体融合，降解，确保其完整複製。端粒酶以其自身RNA为模板，在染色体端部添加上端粒重複序列，并参与端粒长度和细胞增殖的调控。

複製起点：DNA複製通常由起始蛋白与特定的DNA序列相互作用开始。DNA合成的起始位点和DNA複製起点(遗传位点)所需的Cis靶区常位于同一段长约100bp的DNA上。

YAC的主要缺点

1.存在高比例的嵌合体，即一个YAC克隆含有两个本来不相连的独立片段；

2.部分克隆子不稳定，在转代培养中可能会发生缺失或重排；

3.难与酵母染色体区分开，因为YAC与酵母染色体具有相似的结构；

4.操作时容易发生染色体机械切割；

以细菌寄主系统为基础的克隆载体形成嵌合体的频率较低，转化效率高，又易于分离。科学家用“染色体建造”法用F质粒及其调控基因构建细菌载体，克隆大片段DNA。该质粒主要包括oriS, repE(控制F质粒複製)和parA, parB(控制拷贝数)等成分。

BAC的优点

1. 易于用电击法转化E.coli(转化效率比转化酵母高10-100倍)；

2. 超螺旋环状载体，易于操作；

3. F'质粒本身所带的基因控制了质粒的複製；

4. 很少发生体内重排。

有人把人类染色体端粒DNA上单个α-卫星DNA单元多聚化形成1Mb左右的大片段并与人类基因组DNA混合，产生了能被複製，能正常分裂并得到长期稳定保存的人工合成的染色体，长度约为6-10Mb，称为MAC或HAC。

（Yeast artificial chromosomes YACs）PYAC4 遗传结构图

YAC 人工染色体载体是利用酿酒酵母（Saccharomyces cerevisiae）的染色体的複製元件构建的载体，其工作环境也是在酿酒酵母中。酿酒酵母的形态为扁圆形和卵形，生长的代时为 90 分钟；含 16 条染色体，其大小为 225-1900kb ，总计有14×106 bp；具真核 mRNA 的加工活性。

1．YAC人工染色体载体的複製元件和标记基因

在 YAC 载体中最常用的是 pYAC4 。由于酵母的染色体是线状的，因此其在工作状态也是线状的。但是，为了方便製备YAC载体， YAC 载体以环状的方式存在，并增加了普通大肠桿菌质粒载体的複製元件和选择标记，以便保存和增殖。

YAC 载体的複製元件是其核心组成成分，其在酵母中複製的必需元件包括複製起点序列即自主複製序列（autonomously replicating sequence， ARS）、用于有丝分裂和减数分裂功能的着丝粒 （centromere , CEN）和两个端粒（TEL）。

YAC 载体为能够满足自主複製、染色体在子代细胞间的分离及保持染色体稳定的需要，必须含有以下元件：

·端粒重複序列（telomeric repeat ， TEL）：定位于染色体末端一段序列，用于保护线状的 DNA 不被胞内的核酸酶降解，以形成稳定的结构。

·着丝粒（centromere ， CEN）：有丝分裂过程中纺锤丝的结合位点， 使染色体在分裂过程中能正确分配到子细胞中 。在 YAC 中起到保证一个细胞内只有一个人工染色体的作用。如 pYAC4 使用的是酵母第四条染色体的着丝粒。

·自主複製序列（autonomously replication sequences，ARS） 一段特殊的序列，含有酵母菌中 DNA 进行双向複製所必须的信号。

YAC 载体的选择标记主要採用营养缺陷型基因，如色氨酸、亮氨酸和组氨酸合成缺陷型基因 trp 1、 leu 2和 his 3、尿嘧啶合成缺陷型基因 ura3 等，以及赭石突变抑制基因 sup4 。与 YAC 载体配套工作的宿主酵母菌（如AB1380）的胸腺嘧啶合成基因带有一个赭石突变 ade 2-1。带有这个突变的酵母菌在基本培养基上形成红色菌落，当带有赭石突变抑制基因 sup4 的载体存在于细胞中时，可抑制 ade 2-1基因的突变效应，形成正常的白色菌落。利用这一菌落颜色转变的现象，可用于筛选载体中含有外源 DNA 片段插入的重组子。

YAC 载体主要是用来构建大片段 DNA 文库，特别用来构建高等真核生物的基因组文库，并不用作常规的基因克隆。当用 BamHⅠ 切割成线状后，就形成了一个微型酵母染色体，包含染色体複製的必要顺式元件，如自主複製序列、着丝粒和位于两端的端粒。这些元件在酵母菌中可以驱动染色体的複製和分配，从而决定这个微型染色体可以携带酵母染色体大小的 DNA 片段。对于 BamHⅠ切割后形成的微型酵母染色体，当用 EcoRⅠ或 SmaⅠ 切割抑制基因 sup4 内部的位点后形成染色体的两条臂，与外源大片段 DNA 在该切点相连就形成一个大型人工酵母染色体，通过转化进入到酵母菌后可象染色体一样複製，并随细胞分裂分配到子细胞中去，达到克隆大片段DNA 的目的。装载了外源 DNA 片段的重组子导致抑制基因 sup4 插入失活，从而形成红色菌落； 而载体自身连线后转入到酵母细胞后形成白色菌落。这些红色的装载了不同外源 DNA 片段的重组酵母菌菌落的群体就构成了 YAC 文库。 YAC 文库装载的 DNA 片段的大小一般可达 200-500kb，有的可达 1Mb 以上，甚至达到 2Mb 。YAC 载体功能强大，但有一些弊端。这主要表现在 3 个方面：首先，在 YAC 载体的插入片段会出现缺失 （deletion） 和基因重排 （rearrangement） 的现象。其次，容易形成嵌合体。嵌合就是在单个 YAC 中的插入片段由 2 个或多个的独立基因组片段连线组成。嵌合克隆约占总克隆的 5%～50% 。最后， YAC 染色体与宿主细胞的染色体大小相近，影响了 YAC 载体的广泛套用。 YAC 染色体一旦进入酿酒酵母细胞，由于其大小与内源的染色体的大小相近，就很难从中分离出来，不利于进一步分析。但是 YAC 的一个突出优点是，酵母细胞比大肠桿菌对不稳定的、重複的和极端的 DNA 有更强的容忍性。另外， YAC 在功能基因和基因组研究中是一个非常有用的工具。由于高等真核生物的基因大多数是多外显子结构并且有长长的内含子，大型基因组片段可通过 YAC 载体转移到动物或动物细胞系中，进行功能研究。

1．F 质粒

大肠桿菌的 F 因子是一个约 100kb 的质粒。它编码60多种参与複製、分配和接合过程的蛋白质（Willetts and Skurray，1987）。虽然F因子通常以双链闭环DNA（1-2个拷贝/细胞）的形式存在，但它可以在大肠桿菌染色体中至少30个位点处进行随机整合（Low，1987）。携带F因子的细胞，或以游离状态或以整合状态表达三根发样状的F菌毛。F菌毛为供体与受体细胞之间产生性接触所必需。

是基于大肠桿菌的 F 质粒构建的，高通量低拷贝的质粒载体。每个环状 DNA 分子中携带一个抗生素抗性标记，一个来源于大肠桿菌 F 因子（致育因子）的严谨型控制的複製子 oriS （ Shizuya et al. 1992 ），一个易于 DNA 複製的由 ATP 驱动的解旋酶（ （RepE） 以及三个确保低拷贝质粒精确分配至子代细胞的基因座 （ parA , parB , 和 parC ） 。 BAC 载体的低拷贝性可以避免嵌合体的产生，减小外源基因的表达产物对宿主细胞的毒副作用。第一代 BAC 载体 （Shizuya et al. 1992） 不含那些能够用于区分携带重组子的抗生素抗性细菌菌落与携带空载体的细菌菌落的标记物。新型的 BAC 载体可以通过α互补的原理筛选含有插入片段的重组子，并设计了用于回收克隆 DNA 的 Not Ⅰ 酶切位点和用于克隆 DNA 测序的 Sp6 启动子、 T7 启动子 （Kim et al. 1996; Asakawa et al. 1997） 。 Not Ⅰ 识别序列，位点十分稀少。重组子通过 Not Ⅰ 消化后，可以得到完整的插入片段。 Sp6 、 T7 是来源于噬菌体的启动子，用于插入片段末端测序。图 3-28 是 pBeloBAC11 遗传结构图。

BAC 与 YAC 和 PAC（P1 artificial chromosomes ， P1 人工染色体 ） 相似，没有包装限制，因此可接受的基因组 DNA 大小也没有固定的限制。大多数 BAC 文库中克隆的平均大小约 120kb ，然而个别的 BAC 重组子中含有的基因组 DNA 最大可达 300kb 。

F 质粒能够编码形成性菌的蛋白，通过大肠桿菌的结合转移可以进行遗传物质的转移。但是基因操作的时候一般不用这种自发的转化方式。 BAC 载体空载时大小约 7.5kb ，在大肠桿菌中以质粒的形式複製，具有一个氯霉素抗性基因。外源基因组 DNA 片段可以通过酶切、连线克隆到 BAC 载体多克隆位点上，通过电穿孔的方法将连线产物导入大肠桿菌重组缺陷型菌株。装载外源 DNA 后的重组质粒通过氯霉素抗性和 Lac Z 基因的 α – 互补筛选。

（Bacteriophage P1 vectors）

是 Sternberg 基于 P1 噬菌体构建的，与黏粒载体工作原理比较相似的一种高通量载体。它含有很多 P1 噬菌体来源的顺式作用元件，能容纳 70～100kb 大小的基因组DNA片段（Sternberg 1990, 1992, 1994） 。在这种系统中，含有基因组和载体序列的线状重组分子在体外被组装到 P1 噬菌体颗粒中，后者总容量可达 115kb （包括载体和插入片段）。将重组 DNA 注射到表达 Cre 重组酶的大肠桿菌中，线状 DNA 分子通过重组于载体的两个 loxP 位点之间而发生环化。另外，载体还携带一个通用的选择标记 kan r ，一个区分携带外源 DNA 克隆的阳性标记 sacB 以及一个能够使每个细胞都含有约一个拷贝环状重组质粒的 P1 质粒複製子。另一个 P1 複製子（ P1 裂解性複製子）在可诱导的 lac 启动子（IPTG 诱导）控制下，用于 DNA 分离前质粒的扩增。图 3-29 是 P1 噬菌体载体 pAd10sacBII 的遗传结构图。2．P1 人工染色体（P1 artificial chromosomes）

结合了 P1 载体和 BAC 载体的最佳特性，包括阳性选择标记 sacB 及噬菌体 P1 的质粒複製子和裂解性複製子。然而除了将连线产物包装进入噬菌体颗粒以及在 cre-loxP 位点使用位点特异性重组产生质粒分子以外，在载体连线过程中产生的环状重组 PAC 也可能用电穿孔的方法导入大肠桿菌中，并且以单拷贝质粒状态维持 （Ioannou et al. 1994） 。基于 PAC 的人类基因组文库插入片段的大小在 60kb～150kb 之间。

2002年KurofwaY构建成功的转染色体牛，也是在利用构建人人工染色体技术形成的，HAC外周血淋巴细胞中的存留率为91%，远远高于HAC在鼠体内的存留率。

在1995年已利用STS构建了225个酵母人工染色体（YAC）连续克隆重叠群组成的、覆盖範围达整个人类基因组75%的第一代物理图谱。

因此到了1992年，Shizuya等发展了细菌人工染色体(BAC)作为构建基因组文库的载体，BAC质粒以大肠桿菌为宿主，克服了YAC载体的不足之处，同时BAC质粒外源插入片段可达150kb上，能满足物理图谱的构建、染色体的步查等基因组的研究，因而逐渐取代YAC载体成为基因组文库构建的首选载体。

1992年底，陈竺赴法国巴黎人类多态性研究中心拷贝酵母人工染色体基因文库（YAC文库）这是该中心在1992年人类基因组国际会议上宣布赠送给上海第二医科大学陈竺领衔的血液分子生物学实验室的，至此，中国成为世界上第四个拥有此国际最先进基因库的国家。

1990年，科学家研究出细菌人工染色体；1990年，在人类基因组工程启动的同时，研究人员也开始研究如何製造高效稳定的大分子DNA载体—细菌人工染色体（BAC）载体。

1987年，Burke和lson以自主複製序列(ARS)着丝点序列(CEN)和端粒序列(TEL)为基础，加入可在大肠桿菌中行使功能的複製起点(ORI)以及在酵母细胞中的选择标记，成功地构建了酵母人工染色体(YAC)并以此作为克隆运载体与高分子量外源DNA连线，转化酵母细胞。

随着1983年Murray等将酵母菌染色体着丝粒、自主複製序列和端粒连线在一个载体上，构建了第一个酵母人工染色体(YAC)美国华盛顿大学Burke等构建了一个YAC载体，首次将人的DNA大片段插入YAc载体，并导入宿主菌一酵母菌，才使构建覆盖基因组的物理图谱和图位克隆基因成为可能。

自1983年由Murray等人首次成功构建了酵母人工染色体(YAC)以来，人工染色体的研究受到科学家们的广泛关注，并取得迅速发展，人工染色体在基因组分析，基因功能鉴定，基因治疗及染色体结构与功能关係的研究等方面具有重要意义。

1983年。酵母人工染色体构建成功，14年后，第一个HAC的成功构建，被认为是基因治疗载体研究领域的重大突破。1980年，李炳林教授等用亚洲棉与比克氏棉进行杂交，得到异源二倍体杂种，经人工染色体加倍，获得可育的异源四倍体。

1974年所得214株绿色小苗，大多数生长健壮，经人工染色体加倍处理后，移栽于温室中，进行管理和观察，现生长良好，有18个株系已开花结实，已得种子近136粒。

1973年所得39株绿苗，有37株栽培长大，其中32株经人工染色体加倍处理后，有6株正常结实，共收穫种子37粒，现已再次播种繁殖。