土屋昌次是金丸筑前守虎义的次子，幼名平八郎，武田信玄的“奥近习六人众”之一。所谓六人众指的是土屋昌次、三枝守友、武藤喜兵卫（即真田昌幸）、甘利昌忠、曾根昌世和长坂源五郎（即长坂昌国）。

武田家年轻一代里的猛将，对野战和城战都出众的才能。

土屋昌次的初阵就是第四次川中岛合战，当时他年仅十七岁。在这场战役中，他表现异常活跃，负责守卫信玄的本阵，毫无惊慌失措，在上杉军的猛攻之下，始终不曾后退过一步，他的武勇连信玄也为之感慨。这场战役之后，昌次因功被信玄要求继承武田氏的名族土屋氏并正式改名为土屋昌次。

在三方原合战中，土屋昌次接受德川氏大将鸟居元忠的一骑讨，并且击败了鸟居元忠，因此而得到了双方的讚扬。

土屋昌次是信玄近侍出身，对信玄十分忠诚。在信玄病死之后，曾意欲殉死追随信玄公而去，但是为弾正忠正高坂昌信所劝。

长篠合战中，土屋昌次和穴山信君、马场信房、真田信纲、真田昌辉、一条信龙率领三千骑兵的武田军右翼队。面对织田信长的三千支铁炮，昌次所在的部队虽然突破了第二道防马栅，但还是被铁炮挡在了最后一道防马栅之后。5月21日下午1时，昌次在随山县昌景一起突破马防栅冲锋攻击时，两人均遭铁炮击中身亡，昌次时年仅三十二岁。