PCR（PolymeraseChainReaction）技术即聚合酶 链式反应，也称无细胞克隆系统，是1985年诞生的一项DNA体外扩增技术，该技术自问世以来，就以惊人的速度广泛地套用于生命科学的众多领域。

基本原理与方法

PCR技术是一种利用DNA变性与复性原理，在体外利用DNA聚合酶活性，在引物的引导和脱氧核糖核苷酸（dNTP）等参与下将模板DNA在数小时 内进行百万倍扩增。该技术利用两段寡核苷酸作为反应的引物，以及四种脱氧核苷三磷酸dNTP、 DNA聚合酶作为反应物，将提取到的DNA（称为模板DNA）片段精确扩增。该酶促反应最基本的3个 环节是：①模板DNA的变性，即在94℃下模板双链DNA变为单链DNA；②引物与模板链的特异性复性；③由TaqDNA聚合酶催化引物引导DNA链由5'向3'延伸，从而完成一个变性－复性－延伸的PCR循环。至此完成了PCR的第一轮反应，而后反覆进行变性、复性和延伸的循环，从而使扩增 DNA产量呈指数上升。

1．2．1单核细胞增多性李斯特氏菌

单核细胞增多性李斯特氏菌（Listeriamonocy－toyenes，LM）是一种重要的人畜共患病致病病菌， 能引起人和动物脑膜炎、败血症及孕妇流产等，且死亡率极高，可达30%～70%。LM广泛存在于动物、水产品等中，主要通过食物进行传播。过去对食品中LM进行检测时，克隆培养的标準方法需要 3～4周的时间才能得出结果；血清学检测方法（如 王鑫*车振明黄韬睿 （西华大学生物工程学院，成都610039） 分子生物学方法在食品安全检测中的套用 Theapplicationofmolecularbiologymethodstechnologiesinfoodtesting * 王鑫，女，1983年出生，西华大学生物工程学院在读硕士 研究生。 收稿日期：2007－05－14 WangXin*CheZhen－mingHuangTao－rui （Collegeofbioengineering，Xihuauniversity，Chengdu610039，China） 食品工程 FOODENGINEERING ・综述评论・ !!!!!!" !" !!!!!!" !" 7 同等学力分子生物学考试G蛋白偶联受体胺基酸的类型、...2007年第3期 9月出版 ELISA等）也存在着特异性、敏感性差等问题。PCR 技术的出现给李氏菌的检测带来了曙光。姜永强等根据发表的单核细胞增生性李斯特菌的重要毒力基因hlyA的全基因序列，设计出引物，建立了该菌的PCR诊断方法。金大智等运用实时萤光PCR（Re－ al－timePCR）技术建立对食品中单增李氏菌进行检 测的快速方法，设计的引物和探针的序列特异性强，省去凝胶电泳的繁琐，降低了污染的可能性。对26种病原菌进行的检测结果表明，用实时萤光 PCR法检测单核细胞增多李斯特氏菌，更快速、敏 感、特异性更高。

1．2．2金黄色葡萄球菌

金黄色葡萄球菌肠毒素（SE）可引起人类中毒， 其内毒素———中毒休克综合症毒素（TssT1）可引起中毒休克综合症，产生的脱皮毒素（ETA、ETB）与一系列脓疱性葡萄球菌感染有关。Johenson等建立了检测上述毒素基因的PCR技术，可在较短的时间内检测出葡萄球菌毒株，并且具有极高的特异性、敏感性。国内云泓若等选择肠毒素D（SED）基因的第 360～381硷基为上游引物，第654～675硷基为下 游引物，套用PCR技术扩增出SED基因的316bp长的DNA片段，并建立了直接利用细菌裂解液作为模板的PCR方法。

1．2．3沙门氏菌

Nguyen等根据肠炎沙门氏菌C7克隆株具有的属特异性序列（2．1kbHindIII片段）设计出一对引物， 能快速地检测出肉食品标本中的沙门氏菌，检测的敏感性和特异性均为100%，这保证了检测的準确性。沈孝民用PCR技术对各种不同血清型的沙门菌和已知被该菌污染的鱼粉和动物产品的肉汤培养物进行了检测，结果显示该方法特异性高，且灵敏、快速，并可在1d之内完成。

1．2．4肠毒素大肠桿菌

肠毒素大肠桿菌（简称耐热菌）是一种嗜热、嗜 酸、好氧的细菌，能从浓缩苹果汁中分离得到，该菌能经受巴氏杀菌而存活，严重影响浓缩果汁的品质，国际上已有多起耐热菌导致大规模果汁败坏事件的报导。检测结果的滞后性使之无法及时指导生产，无法及时向生产线反馈信息 以採取相应的防範、控制与清洗措施。 PCR技术能使微量的核酸在数小时之内扩增至 原来的数百万倍以上，只要选择适合的引物，就可特异性地大量扩增某一特定的DNA片断至易检测水平。因此理论上可以通过特异性地扩增耐热菌的基因片断而对其实现快速检测。

PCR技术虽为一种快速、特异、灵敏、简便、 高效的检测新技术，但其在食品中致毒、致病性微生物检测的实际套用中也存在不少问题，必须认真分析各种具体情况，採取必要的措施，以提高反应的特异性和敏感性，避免假阳性或假阴性结果。

1．3．1污染问题

PCR是一种极为灵敏的反应，一旦有极少量外 源性DNA污染，就可能出现假阳性结果，所以在操作时必须加以注意。

1．3．2假阴性问题

食品是複杂的反应基质，影响PCR反应的因素 很多，如果不能有效排除各影响因素的干扰，很可能出现假阴性结果。此外，如果在PCR操作过程中各种实验条件控制不当，很容易导致产物突变，也会导致假阴性结果。对于这些问题必须有充分的考虑和排除措施。

1．3．3引物设计及靶序列选择

引物的设计及靶序列的选择是决定PCR结果的 关键因素，引物不同则扩增物不同，如果引物的设计不当，则直接影响对关键靶序列的选择，降低 PCR检测的灵敏度和特异性，甚至完全失败。因而，必须对扩增序列有充分的了解，并规範PCR实 验室操作技术。 儘管PCR技术在食品的微生物安全性检测方面还存在着一些问题，但相信随着研究的深入，这项技术必将得以完善，并迅速成为可以信赖的快速检测手段。 2基因晶片技术 基因晶片技术是鉴别微生物和转基因成分最有效的手段之一，为全面、快速、準确地进行食品安全检测提供了一个崭新的平台。基因晶片（DNA晶片、DNA微阵列）技术是近十几年来在生命科学领域迅速发展起来的一项高新技术，是一项基于基因表达和基因功能研究的革命性技术，他综合了分子 食品工程 82007年第3期9月出版 王鑫：分子生物学方法在食品安全检测中的套用 生物学、半导体微电子、雷射、化学染料等领域的最新科学技术，在生命科学和信息科学之间架起了一道桥樑，是当今世界上高度交叉、高度综合的前沿学科和研究热点。

将各种基因寡核苷酸点样于晶片表面，微生物 样品DNA经PCR扩增后，製备萤光标记探针，然后再与晶片上的寡核苷酸点杂交，最后通过扫瞄器定量和分析萤光分布模式来确定检测样品是否存在某些特定微生物。 该技术可检测各种介质中的微生物，研究複杂微生物群体的基因表达。与传统的检测方法（细菌培养、生化鉴定、血清分型等）相比，基因晶片技术的先进性主要体现在：①基因晶片可以实现微生物的高通量和并行检测，一次实验即可得出全部结果； ②操作简便快速，整个检测只需4h基本可以出结果（而传统方法一般需4d￣7d）；③特异性强，敏感 性高。

2．2基因晶片技术在食品微生物检测方面的套用

食品卫生检测中一个重要的方面是及时準确的 检测出食品中的病原性微生物，这些致病微生物的存在会严重威胁人类的健康。不洁或者带有致病菌的食品不仅造成巨大的经济损失，还会严重危害消费者的健康，从食品的生产、加工、运输、销售、消费的各个环节都极易被各种病菌污染。FDN统计表明，在抽检的一部分食品中，过去5年由于受致病菌污染而从市场上撤回的食品数量增加了5￣6倍。中国在加入WTO后面临同样的问题，过去l0年中不仅发现了许多新的病菌，而且一些已知病菌也出现了抗性增强的趋势；以前被认为无害的微生物在获得致病基因和抗性后也会导致许多致命的疾病。由于缺乏合适的检测方法，这些致病菌即使偶尔出现在食品中，也不能及时被检测出来，对人类健康造成一定的威胁。食品微生物的检验是确保食品质量和安全的重要手段，因此加强对有害病菌的筛选与检测，可有效防止食品被各种微生物特别是致病菌的污染和各种传染病的蔓延。 传统的生化培养检测方法需要经过几天的微生物培养和複杂的计数，操作繁杂，不能及时反映生产过程或销售过程中的污染情况，且灵敏度不高， 使得食品的安全检测潜在一定的危险，给消费者带来很大的威胁；PCR法快速，比前者灵敏，但成本高，假阳性多，也不是很好的检测食品微生物污染的方法。基因晶片可广泛的套用于各种导致食品腐败的致病菌的检测，该技术具有快速、準确、灵敏等优点，可以及时反映食品中微生物的污染情况。国内外都已开始食品微生物检测晶片的研究，并取得了一些肯定的结论。 基因晶片专一性好，能够对食品中污染的微生物实现快速的线上检测，及时反映食品中存在的问题，为危害分析的关键控制点（hazardanalysiscritical controlpoint）提供可行的权威性报告。 DNA晶片还能对农作物致病菌包括病毒、细 菌、真菌和线虫迅速作出检测，常常能达到株或属的水平，保证食品原料的安全性；能对畜类、水产类进行微生物检测；鉴别乳製品的好坏；检测肉製品的优劣，真实判断肉混合製品中某种成分的数量。从1993年开始，我国每年都会爆发对虾流行性病毒病，其危害是灾难性的，中国科学院海洋所的徐洪涛藉助DNA杂交技术，将该病毒的DNA作成探针进行杂交，从分子生物学角度证明白斑病毒感染是造成中国大陆对虾连年爆发流行病的主要原因。

基因晶片技术存在的问题与展望

2．3．1存在问题

基因晶片技术的研究和套用前景十分诱人，但作为一项新技术，仍有一些问题需要解决：①该技术需要大量的已测知的、準确的DNA、cDNA片段的信息，他们使该技术成为大规模、集成化和整体获取生物信息的有效手段；②由于晶片製作工艺複杂，信号检测也需专门的仪器设备，一般实验室难以承担其高昂的费用；③样品製备和标记比较複杂，没有一个统一的质量控制标準；④实验室不能共享数据和资料库等。这些都在一定程度上限制了基因晶片技术在食品检测中的套用。

2．3．2解决方法与发展方向

为使基因晶片成为实验室研究或实践中可以普 遍採用的技术，须从以下几方面着手解决问题：①提高基因晶片的特异性、重複性；②简化样品製备和标记操作；③增加信号检测的灵敏度；④研製和开发高度集成化的样品製备、基因扩增、核酸标记及检测仪器。另外，食品及食品原料中不断出现的新转入基因及食品病原微生物的複杂化，也是食品 9 2007年第3期 9月出版 检测中套用基因晶片技术需要解决的问题。 基因晶片技术儘管存在一定的不足和局限，但该技术具有检测系统微型化、检测样品微量化的特点，同时兼具检测效率高、能同时分析多种基因或诊断DNA序列的优势，很适于食品中病原微生物和转基因成分的检测及鉴定。随着研究的不断深入和技术的完善，基因晶片技术一定会在食品科学研究领域发挥越来越重要的作用。 3其他分子生物学检测技术

核酸探针是指带有标记的特异DNA片断。根据硷基互补原则，核酸探针能特异性地与目的DNA杂交，最后用特定的方法测定标记物。探针标记方式分为放射性标记、非放射性标记。放射性标记的核酸探针的特异性非常强，检测病原微生物速度比常规方法快得多

基因重组法

由于基因重组，尤其是转化作用，仅出现于同 种或亲缘关係十分近的菌株之间，所以基因重组技术可以用于细菌的分类和鉴定中。如用转化法测定由食品传染的、能引起痢疾的志贺氏细菌。基因重组法无需对待测菌株进行纯培养，而且无需什幺特殊的试剂和设备，简便易行，所以是一种很有前途的鉴定法。 4结束语 食品安全检测中一个十分重要的内容是及时準确地检测出食品中的病原微生物。传统的微生物检测方法虽然有效且特异性高，但存在检测成本高、速度慢、效率低等问题，难以满足现代社会快速检测的要求，并且由于传统的微生物检测方法基本上都需要对病原菌进行人工培养，对一些生长缓慢或是新的病原菌就难以用传统方法进行检测。另外，对近些年来出现的转基因食品中转基因成分的安全检测也难以用传统检测方法进行检测。而基因探针术、PCR技术等作为现代生物学技术手段套用于食品微生物或食品中转基因成分的检测，克服了传统 食品安全检测方法的缺点和不足，而且还具有灵敏度高、操作简便、检测周期短、检测成本低等优点。DNA探针杂交与PCR联合使用检测食品微生物将是今后食品微生物检测技术的一个重要研究方向，若能克服两者存在的易污染产生假阳性结果的缺失，相信大规模推广套用指日可待。