适用于菌种长期保存，一般可保存数年至十余年，但设备和操作都比较複杂。

（1）準备安瓿管用于冷冻乾燥菌种保藏的安瓿管宜採用中性玻璃製造，形状可用长颈球形底的，亦称泪滴型安瓿管，大小要求外径6-7.5mm，长105mm，球部直径9-11mm，壁厚0.6-1.2mm。也可用没有球部的管状安瓿管。塞好棉塞，1.05kg/cm，121.3℃灭菌30分钟，备用。

（2）準备菌种，用冷冻乾燥法保藏的菌种，其保藏期可达数年至十数年，为了在许多年后不出差错，故所用菌种要特别注意其纯度，即不能有杂菌污染，然后在最适培养基中用最适温度培养，使培养出良好的培养物。细菌和酵母的菌龄要求超过对数生长期，若用对数生长期的菌种进行保藏，其存活率反而降低。一般，细菌要求24—48小时的培养物；酵母需培养3天；形成孢子的微生物则宜保存孢子；放线菌与丝状真菌则培养7-10天。

（3）製备菌悬液与分装以细菌斜面为例，用脱脂牛乳2ml左右加入斜面试管中，製成浓菌液，每支安瓿管分装0.2ml。

（4）冷冻冷冻乾燥器有成套的装置出售，价值昂贵，此处介绍的是简易方法与装置，可达到同样的目的。

将分装好的安瓿管放低温冰柜中冷冻，无低温冰柜可用冷冻剂如乾冰（固体CO2）酒精液或乾冰丙酮液，温度可达-70℃。将安瓿管插入冷冻剂，只需冷冻4-5分钟，即可使悬液结冰。

（5）真空乾燥为在真空乾燥时使样品保持冻结状态，需準备冷冻槽，槽内放碎冰块与食盐，混合均匀，可冷至-15℃。装置仪器，安瓿管放入冷冻槽中的乾燥瓶内。

抽气一般若在30分钟内能达到93.3Pa（0.7mmHg）真空度时，则乾燥物不致熔化，以后再继续抽气，几小时内，肉眼可观察到被乾燥物已趋乾燥，一般抽到真空度26.7Pa（0.2mmHg），保持压力6-8小时即可。

（6）封口抽真空乾燥后，取出安瓿管，接在封口用的玻璃管上，可用L形五通管继续抽气，约10分钟即可达到26.7Pa（0.2mmHg）。于真空状态下，以煤气喷灯的细火焰在安瓿管颈中央进行封口。封口以后，保存于冰柜或室温暗处。