《保健食品中褪黑素含量的测定》是2003年8月11日由卫生部颁布的国家行业标準，自2004年1月1日起实施，现行有效。本标準规定了以褪黑素为有效成分的胶囊或片剂包装的保健食品中褪黑素的测定方法。本标準适用于以褪黑素为有效成分的胶囊或片剂包装的保健食品中褪黑素的测定。
基本介绍
- 中文名：保健食品中褪黑素含量的测定
- 外文名：Determination of melatonin in healthy foods
- 标準号 ：GB/T 5009.170-2003
- 标準分类号： C53
- 类别： 国家标準
- 发布日期 ： 2003-8-11
範围
本标準规定了以褪黑素为有效成分的胶囊或片剂包装的保健食品中褪黑素的测定方法。
本标準适用于以褪黑素为有效成分的胶囊或片剂包装的保健食品中褪黑素的测定。
本标準第一法高效液相色谱一紫外检测法的检出限为0.5 ng；取样量0.5 g时，检出浓度为0.07 mg/kg。第二法高效液相色谱一萤光法的检出限为30 pg，线性範围为0.05 ng～0.50 ng。
第一法高效液相色谱一紫外检测法
原理
试样中的褪黑素经溶解、稀释、过滤后，使用具有紫外检测器的高效液相色谱仪检测，根据色谱峰的保留时间定性，外标法定量。
试剂
除非另有说明，在分析中仅使用确定为分析纯的试剂和蒸馏水或去离子水或相当纯度的水。
1、甲醇：色谱纯。
2、无水乙醇：优级纯。
3、三氟乙酸：优级纯。
4、高效液相色谱流动相：甲醇+水+三氟乙酸=45+55+0.05。
5、褪黑素(Melatonin)标準品。
6、褪黑素标準溶液的配製
精确称量30 mg褪黑素标準品于100 mL容量瓶中，加入70%乙醇溶解后定容至刻度。準确吸取2mL上述溶液于10 mL容量瓶中，加人流动相定容至刻度，此溶液浓度为0.060 mg/mL。
仪器设备
1、高效液相色谱仪：附紫外检测器。
2、超音波清洗器。
3、离心机。
分析步骤
1、试样处理：使用研钵将片剂或胶囊研成粉末并使之混合均匀。
2、精确称量约一粒片剂或胶囊的质量于10 mL容量瓶中，以70%乙醇定容至刻度，使用超音波清洗器提取10 min。将提取液离心至澄清。準确量取上清液2 mL于10 mL容量瓶中，以流动相定容至刻度，混匀后经0.45μm滤膜过滤后进行色谱分析。
3、测定
（1）液相色谱参考条件
色谱柱：μ一BondaPak C18，4.6 mm X250 mm。
紫外检测器：检测波长222 nm。
流速：0.8 mL/min。
柱温：室温。
（2）色谱分析
量取10μL标準溶液及试样净化液注入高效液相色谱仪中，以保留时间定性，以试样峰高或峰面积与标準比较定量。
（3）色谱图
见图1。
图1
图1结果计算
按式(1)计算：
X=h/hi×c×10×10/2×1000/m
式中：
X——试样中褪黑素的含量，单位为毫克每千克(mg/kg)；
h——试样的峰高或峰面积；
hi——标準的峰高或峰面积；
c——褪黑素标準溶液的浓度，单位为毫克每毫升(mg/mL)；
m——试样质量，单位为克(g)。
计算结果保留两位有效数字。
精密度
在重複性条件下获得的两次独立测定结果的绝对差值不得超过算术平均值的5%。
第二法高效液相色谱萤光法
原理
试样中褪黑素经甲醇反覆提取，製成甲醇溶液，按一定比例进行稀释后，注入高效液相色谱仪，经反相色谱分离，以萤光检测器进行检测，根据保留时间定性和与标準品峰面积比较进行定量。
试剂
1、甲醇：重蒸。
2、褪黑素标準品：纯度为99.7%。
（1）储备溶液：精密称取褪黑素标準品0.0100 g，用甲醇溶解并配成1 g/L的储备溶液，于一20℃保存。
（2）使用溶液：使用前精密量取一定量标準品储备溶液，根据褪黑素在仪器上的回响情况，用甲醇稀释成标準使用溶液。
仪器
1、高效液相色谱仪：附萤光检测器和微处理机。
2、离心机。
3、超音波清洗机。
试样製备
片剂研细备用；胶囊内容物混合均匀备用。
分析步骤
1、提取
精密称取试样0．2000g于5 mL的刻度试管中，加甲醇约3mL，超声振荡10 min，离心，取上清液于10 mL容量瓶中，再加甲醇约3 mL于残渣中，按前述方法重複提取2次，合併上清液，加甲醇至刻度，摇匀。取此溶液适量，用甲醇稀释并定容，製成试样溶液待测。
2、测定
（1）高效液相色谱条件
色谱柱：Alltima C18 4.6 mm×250 mm不鏽钢柱。
流动相：甲醇。
流速：1 mL/min。
进样量：10μL。
检测器：萤光检测器，激发光波长286 nm，发射光波长352 nm。
（2）色谱分析
将仪器调至最佳状态后，分别将10μL标準溶液及净化后试样液注入色谱仪中，以保留时间定性，以试样峰高或峰面积与标準比较定量。本方法线范性围为0.05 ng～0.50 ng。
（3）色谱图
色谱图见图2。
图2
图2结果计算
按（2）计算：
X=m1×V2×1000/m×V1×1000×n
式中：
X——试样中褪黑素的含量，单位为毫克每千克(mg/kg)；
m1——被测样液中褪黑素的含量，单位为纳克(ng)；
m——试样质量，单位为克(g)；
V1——样液进样体积，单位为微升(μL)；
V2——试样稀释液总体积，单位为毫升(mL)；
n——稀释倍数。
计算结果保留两位有效数字。
精密度
在重複性条件下获得的两次独立测定结果的绝对差值不得超过算术平均值的10%。